MikroRNA ekspresyon seviyeleri ve genetik varyasyonları ile eksfoliasyon sendromu ve eksfoliatif glokom ilişkisinin incelenmesi

Abstract

Eksfoliasyon sendromu (XFS) yaş arttıkça daha fazla gelişim gösterdiği bilinen, anormal fibriler moleküllerin göz dokularında birikmesi ile tanımlanan bir hücre dışı matriks hastalığıdır. XFS'nin patogenezinde oksidatif ve hücresel stres ile inflamatuar yolaklar önemli yer tutmaktadır. Aköz hümör sıvısının drenajını sağlayan kanalların eksfoliasyon birikintisi ile tıkanması ve bu suretle göz içi basıncının (GİB) artmasıyla ortaya çıkan eksfoliatif glokom (XFG), tedavi edilmediği takdirde körlüğe sebep olabilmektedir. Bu nedenlerle XFS'nin erken dönemde teşhisinin önemi büyüktür. mikroRNA'lar (miRNA) mesajcı RNA'ların (mRNA) regülasyonunda rol oynayan önemli post-transkripsiyonel düzenleyicilerdir. miRNA ekspresyon seviyelerinin çeşitli hastalıklarda değiştiği belirlenmiştir. miRNA'ların genlerinde bulunan tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP), miRNA'ların işlenmesini etkilediği ve çeşitli hastalıklara yatkınlıkta rol oynayabildiği bilinmektedir. Bu çalışmada, inflamasyon ile ilişkili yolaklarda rol oynadığı bilinen miR-146a ve miR-196a-2'nin plazma ekspresyon seviyeleri ile mir-146a rs2910164 G/C ve mir-196a-2 rs11614913 C/T SNP'lerinin XFS ve XFG hastalıkları için biyobelirteç olma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışma grubu, genotipleme kısmında, 260 XFG hastası, 260 XFS hastası ve 295 kontrolden oluşurken, ekspresyon seviyesi belirleme kısmında, her grup içerisinden 27 XFG hastası, 25 XFS hastası ve 27 kontrolden oluşmaktadır. Kan örnekleri Gülhane Eğitim ve Araştırma Hastanesi Göz Hastalıkları Bölümü (Ankara, Türkiye) tarafından toplanmıştır. SNP'lerin genotiplemeleri PCR-RFLP yöntemi ile, miRNA'ların plazmadaki ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi ise qRT-PCR yöntemi ile yapılmıştır. Relatif ekspresyon seviyeleri 2-??Ct yöntemi ile hesaplanmıştır. Genotip analizlerine göre, rs2910164 ve rs11614913 için minör alel frekanslarının ve genotip dağılımlarının, XFG, XFS ve kontrol grupları arasında farklı olmadığı görülmüştür. Plazma hsa-miR-146a-5p relatif ekspresyon seviyesinin, XFG ve XFS gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı ölçüde yüksek olduğu tespit edilmiştir (XFG vs. kontrol: P<.001, XFS vs. kontrol: P=.001). Hsa-miR-196a-5p relatif ekspresyon seviyesinin ise, gruplar arasında farklı olmadığı görülmüştür. Lojistik regresyon analizleri sonucunda, plazma hsa-miR-146a-5p relatif ekspresyon seviyesinin XFG ile yaklaşık 6 kat (P=.001; dominant model), XFS ile yaklaşık 4 kat (P=.005; dominant model) ilişkili olduğu tespit edilmiştir. ROC analizleri sonucunda, plazma hsa-miR-146a-5p relatif ekspresyon seviyesinin, XFG için "iyi" (AUC=0.897, P<.001, duyarlılık=%89, özgüllük=%78), XFS için "orta" (AUC=0.779, P=.001, duyarlılık=%52, özgüllük=%93) dereceli bir tanı testi olabileceği görülmüştür. Bu çalışmada, mir-146a rs2910164 G/C ve mir-196a-2 rs11614913 C/T SNP'leri ve miR-146a ve miR-196a-2'nin plazma ekspresyon seviyeleri ile XFS ve XFG arasındaki ilişki ilk kez araştırılmıştır. Sonuç olarak, hsa-miR-146a-5p relatif ekspresyon seviyesinin, XFG ve XFS için kan tabanlı biyobelirteç olma potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. Bu tez çalışması ileride XFG ve XFS'nin erken teşhisi, prognozun takibi ve tedavisinde kullanılabilecek yeni tanı testleri, biyosensörler ve terapötik ajanlar geliştirilmesine öncülük edecek potansiyele sahip sonuçlar ortaya koyması nedeniyle Biyomedikal Mühendisliğine katkı sağlayan bir projedir.

Exfoliation syndrome (XFS) is an extracellular matrix disease defined by the accumulation of abnormal fibrillary molecules in the eye tissues, which is known to develop more with age. Oxidative and cellular stress and inflammatory pathways play an important role in the pathogenesis of XFS. Exfoliative glaucoma (XFG), which occurs when the channels that provide drainage of aqueous humor fluid are blocked by exfoliation deposits and therefore increase in intraocular pressure, can lead to blindness if left untreated. For these reasons, early diagnosis of XFS is of great importance. microRNAs (miRNA) are significant post-transcriptional regulators that play a role in the regulation of messenger RNAs (mRNA). It has been determined that miRNA expression levels vary in various diseases. It is known that single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes of miRNAs impact the processing of miRNAs and may play a role in susceptibility to various diseases. In this study, it is aimed to examine the potential of plasma expression levels of miR-196a-2 and miR-146a which are known to play a role in inflammation-related pathways, as well as the potential of mir-146a rs2910164 G/C, mir-196a-2 rs11614913 C/T SNPs as biomarkers for XFS and XFG diseases. The study group consisted of 260 patients with XFG, 260 patients with XFS and 295 control individuals in the genotyping part, and 27 patients with XFG, 25 patients with XFS and 27 controls were selected from each group for expression level determination. Blood samples were collected by Gulhane Training and Research Hospital, Department of Ophthalmology (Ankara, Turkey). Genotyping of SNPs was performed by using PCR-RFLP method, and expression levels of miRNAs in plasma were determined by using qRT-PCR method. Relative expression levels were calculated by the 2-??Ct method. According to the genotype analysis, minor allele frequencies and genotype distributions for rs2910164 and rs11614913 were not different between XFG, XFS and control groups. It was found that the relative expression level of plasma hsa-miR-146a-5p was significantly higher in the XFG and XFS groups compared to the control group (XFG vs. control: P<.001, XFS vs. control: P=.001). Relative expression levels of hsa-miR-196a-5p were not different between the groups. As a result of logistic regression analysis, it was determined that the relative expression level of plasma hsa-miR-146a-5p was associated approximately 6-fold with XFG (P=.001; dominant model), and approximately 4-fold with XFS (P=.005; dominant model). As a result of ROC analysis, it was concluded that the relative expression level of hsa-miR-146a-5p in plasma could be a "good" level (AUC=0.897, P<.001, sensitivity=89%, specificity=78%) diagnostic test for XFG and a "fair" level (AUC=0.779, P=.001, sensitivity=52%, specificity=93%) diagnostic test for XFS. In this study, the relationship between mir-146a rs2910164 G/C and mir-196a-2 rs11614913 C/T SNPs, the plasma expression levels of miR-146a and miR-196a-2 and XFS and XFG was investigated for the first time. In conclusion, it was observed that the relative expression level of hsa-miR-146a-5p has the potential to be a blood-based biomarker for XFG and XFS. This thesis is a project that contributes to Biomedical Engineering, as it reveals results that have the potential to lead to the development of new diagnostic tests, biosensors and therapeutic agents that can be used in the early diagnosis, following the prognosis and treatment of XFG and XFS in the future.