Damar içi implant materyal yüzeylerinde antitrombojenik ve antibakteriyel aktiviteyi artirmaya yönelik heparin immobilizasyonu

Abstract

Geçici ya da kalıcı, dahili ya da harici olarak, tedavi ve/veya onarım gibi amaçlarla vücuda dahil edilen malzemeler implant materyalleri olarak adlandırılmaktadırlar. Günümüzde artan popülasyon ve uzun yaşam süreleri göz önüne alındığında, implant materyallerin kullanım sıklığı, miktarı ve süreleri giderek artmaktadır. Bu nedenle kullanılan implantların, kullanıldıkları bölgeye uyum sağlamaları, transplantasyon sonrası herhangi bir komplikasyon oluşmasını önleyecek şekilde tasarlanmaları gerektiği sonucuna ulaşılmaktadır. Tez kapsamında polimerik ve metalik alttaşlar olmak üzere iki farklı malzemede heparin adı verilen, klinikte güncel olarak antikoagülan ilaç olarak kullanılan biyomolekül ile yüzey modifikasyon stratejilerinin geliştirilmesi üzerine çalışılmıştır. Polipropilen (PP) tez kapsamında model polimerik malzeme olarak seçilmiş ve iki basamakta plazma polimerizasyon (PlzP) destekli yüzey modifikasyonu gerçekleştirilmiştir; (i) oksijen ile aşındırma ve (ii) amince zengin fonksiyonel grup oluşturma. PlzP tekniği ile geliştirilen yüzey modifikasyon parametreleri, temas açısı ölçüm, serbest yüzey enerji hesaplamaları, yüzeyde maksimum azot miktarını elde etme, yüzey pürüzlük değerinin artırılması kriterleri kapsamında değerlendirilmiş ve optimize parametre tespit edilmiştir. Heparin immobilizasyon işlemi, saf heparin (hep) ve kovalent bağ ajanları ile destekli (hep*) çözeltiler kullanılarak 3 farklı konsantrasyon üzerinden test edilmiştir. Yüzeye tutunumu sağlanan heparin miktarı Toluidine Mavi (TB) boya ile tespit edilmiş ve maksimum heparin tutunumunun sağlandığı konsantrasyon, optimize parametre olarak belirlenmiştir. Kovalent bağ ajanları ile destekli heparin çözeltisinin iki basamakta modifiye edilen PP yüzeyler ile kovalent bağ oluşturduğu, FTIR-ATR analizinde saptanan amid I ve II pikleri ile kanıtlanmıştır. Heparin immobilizasyonu protein tutunum miktarını referans yüzeylere göre oldukça azaltmış, hemokompatibilite testleri kapsamında (platelet tutunum, hemoliz, kinetik-kan pıhtılaşma oranı) da oldukça etkili sonuçlar vermiştir. Ayrıca heparin immobilizasyonunun PP yüzeylerde antiadherent karakteristiği gram pozitif ve gram negatif bakteriler ile test edilmiş ve heparinin antibakteriyel mekanizmasının "temas ile öldürme" olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Son olarak BJ insan fibroblast hücreleri ile gerçekleştirilen testler sonucunda, geliştirilen yüzeylerin biyouyumlu oldukları ispatlanmıştır. Titanyum (Ti) tez kapsamında model metalik malzeme olarak seçilmiş ve tek basamakta alternatif akım elektroforetik depozisyon (AC-EPD) tekniği ile heparin modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Saf halde heparin depozisyonu, temas açısı ölçüm, serbest yüzey enerji hesaplamaları ve yüzey pürüzlülük değerleri kapsamında incelenmiş ve optimize parametre tespit edilmiştir. Başlangıçta yüzeye depozite edilen heparin miktarı TB boya ile takip edilmiş olmakla birlikte, ilerleyen deney basamaklarında söz konusu yaklaşımın, AC-EPD tekniği ile kaplanan heparin miktarını saptamada yetersiz olduğu saptanmıştır. Ti yüzeylerde heparin depozisyonunun etkisi, PP yüzeylerde olduğu gibi, protein tutunum miktarı, hemokompatibilite testleri, antiadherent karakteristik ve biyouyumluluk testleri kapsamında detaylı olarak araştırılmıştır. Özetle, tez kapsamında gerçekleştirilen çalışmalar ile hem PP hem de Ti yüzeylerde farklı stratejilerle yüzey modifikasyonları gerçekleştirilerek heparinin mevcut antikoagülan karakteristiğinden yararlanmakla birlikte, antibakteriyel, antiadherent ve biyouyumluluk karakteristikleri de detaylı olarak çalışılmış ve literatüre kazandırılmıştır.

Implantable materials are tools that are used in the human body for temporary or permanent, internal or external, treatment or repair, and so on. Nowadays, due to the growing population and long lifetime, the rate, quantity, and duration of these materials are also increasing. Therefore, implantable materials should be biocompatible with the environment in their usage area and be designed to prevent any complications after the transplant. Within the scope of this thesis, two different materials were used as polymeric and metallic substrates for surface modification with an anticoagulation drug that is used in clinics, heparin. Polypropylene (PP) was selected as a model polymeric substrate and plasma-assisted surface modification was applied in two steps: (i) oxygen etching and (ii) amine-rich functional group creation. Surface modification parameters that were held with the plasma polymerization (PlzP) technique were analyzed with contact angle measurements, surface free energy calculations, obtaining the maximum nitrogen amount on the surfaces and increasing the surface roughness values, etc., and the parameters were optimized accordingly. Immobilization of heparin applied as pure heparin (hep) and covalent bond agent assisted (hep*) with 3 different concentration values. The amount of immobilized heparin detected with toluidine blue (TB) dye and the parameter that produces the maximum amount of immobilized heparin were selected as optimal. Covalent bond formation between hep* and PP substrates was proven with amide I and II peaks, which were detected with FTIR-ATR analysis. Compared to the bare PP substrates, heparin immobilization provided a lower amount of adhered protein and much more efficient hemocompatibility testing (platelet adhesion, hemolysis, and kinetic blood coagulation rate) results. Also, the antiadhesive characteristics of heparin-immobilized PP surfaces were tested against both gram-positive and gram-negative bacteria strains, and the antibacterial mechanism of heparin was revealed as "contact killing". Lastly, the biocompatibility of produced surfaces was tested with the BJ human fibroblast cell line. On the other hand, titanium (Ti) was selected as the model metallic substrate, and heparin immobilization onto the surfaces was held in one step with the alternative current electrophoretic deposition (AC-EPD) technique. Parameter optimization was achieved with contact angle measurements, free surface energy calculations, and the surface roughness values of purely deposited heparin. In the beginning, the deposited heparin amount was detected with TB dye, but according to further analysis, this procedure is not appropriate to detect the heparin amount that was deposited with the AC-EPD technique. The effect of heparin deposition on Ti substrates was examined detailedly with adhered protein amount, hemocompatibility tests, antiadhesive characteristics, and biocompatibility, respectively. In brief, within the scope of the thesis, different surface modification techniques with heparin on both PP and Ti surfaces were examined. With the help of the anticoagulant characteristic of heparin, which is already known, also its antibacterial, antiadherent, and biocompatibility characteristics were examined in detail and brought to the literature.